实验操作流程:
成骨诱导培养液配备与诱导操作:
1、准备含10%FBS的α-MEM培养液;
2、在备好的α-MEM培养液中添加50μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松;
3、准备6孔培养板,将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始α-MEM培养液中;
4、待细胞长至基本融合后,更换上述制备完成的成骨诱导培养液;
5、每三天换液一次,细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色;
6、二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。
素红染色方法介绍:
1、去除细胞当前使用培养液,使用PBS清洗两次;
2、使用10%甲醛室温固定15分钟,完成后使用重蒸馏水冲洗两次;
3、按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液,室温孵育20min并轻微振荡;
4、清除掉没有完全结合的染料,用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次;
5、倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水;倒置显微镜观察拍照记录。
成脂诱导培养液配备与诱导操作:
1、配置FBS10%含量的HG-DMEM培养液;
2、在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素,200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX;
3、准备6孔培养板,将P4细胞按照2×104个/平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM培养液中
4、待细胞长至基本融合后,更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天,在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培 养1天,如此交替循环培养至14天,使用红油O染色。 红油O染色方法介绍: 1、去除细胞使用的当前培养液,使用PBS清洗两次;
2、27.5%甲醛室温固定20分钟;
3、重蒸馏水清洗3此,空气中干燥;
4、加入0.5%的红油室温孵育一小时;
5、配制70%乙醇溶液清洗3次;
6、倒置显微镜观察拍照记录。
客户提供: 细胞种类和诱导分化细胞类型。
交付标准:
1、成功定向诱导分化的细胞。
2、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)。