实验操作流程:
(培养人脐静脉内皮细胞为例)
1、新生儿脐带:在无菌条件下,于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。长度>20 cm,两端扎紧投入到 4℃脐带保存液中,1h内送细胞培养室。
2、剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分,尽量挤干净脐带内血液。
3、用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。
4、用输血器内接有穿刺器的软管,找到脐静脉,将软管针头一端插入脐静脉,用止水夹固定,另一端接 20 m1注射器,吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止;将脐带另一端用止血钳夹闭,向脐静脉中灌入0.1% I型胶原酶溶液,使之充盈,夹闭软管。
5、37℃水浴中孵育20 min,其间轻轻挤压并旋转脐带,以使酶溶液充分接触血管内壁。
6、将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉,一并收集于小三角瓶中,将细胞悬液装入10 ml离心管,1000 r/min离心10 min,弃上清,吹打悬浮,再次离心10 min,重悬细胞并接种于铺有明胶的25 cm2培养瓶中,置于37℃ 5% C02饱和湿度培养箱中培养,24h后更换培养液,以后每隔2d换液1次。
7、脐静脉内皮细胞的传代培养:当原代细胞融合80%以上后,加入 0.05% 胰蛋白酶一0.02%EDTA 溶液消化,倒置显微镜下观察,当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液,加入细胞培养液终止消化,收集细胞悬液。1 000 r/min离心10 min,弃上清,制成单细胞悬液。此时可用0.5%台盼蓝染色,计算活细胞百分率,并以血细胞计数板计数。调整细胞浓度为1×10 个/ml,接种于培养瓶或培养板中继续培养。待细胞长满,彼此融合成片时依上述方法继续传代培养。
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1、细胞
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